一、原理
DNS即二硝基水杨酸法,利用碱性条件下,二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应,生成3氨基5硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下显棕红色,且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系,通过比色法可测定还原糖含量。
二、试剂制备
1、葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml,即含葡萄糖为1.0mg/ml。
2、DNS试剂:称取6.3g3,5二硝基水杨酸用400mL蒸馏水溶解,逐步加入氢氧化钠,再加入四水合酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠,温水浴,不断搅拌,直至溶液清澈透明,用蒸馏水定容至1000mL,保存在棕色瓶中,静置57天后使用,贮存期为6个月。
三、标准曲线绘制
试管编号 | 葡萄糖标准液(1mg/ml)(ml) | 蒸馏水(ml) | DNS试剂(ml) | 吸光度 |
1 | 2.0 | 2.0 | ||
2 | 0.2 | 1.8 | 2.0 | 0.239 |
3 | 0.4 | 1.6 | 2.0 | 0.462 |
4 | 0.6 | 1.4 | 2.0 | 0.685 |
5 | 0.8 | 1.4 | 2.0 | 0.885 |
6 | 1.0 | 1.2 | 2.0 | 1.178 |
分别取葡萄糖标准液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中,用蒸馏水补足至1.0ml,然后每管分别准确加入DNS试剂2ml,沸水浴加热2min,流水冷却,用水补足到15ml刻度,在540nm波长下测定吸光度。
四、样品测定
1、将发酵液稀释一定倍数后,取3只比色管标号1、2、3,各加入稀释后的发酵液0.5 ml,再分别加入DNS试剂0.5 ml混匀,沸水浴5min,冷却后加入4 ml蒸馏水混匀,在540 nm下测吸光度。
2、样品液适当稀释,使糖浓度为0.11.0mg/ml,取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中,加DNS试剂2.0ml,沸水煮沸2min,冷却后用水补足到15ml刻度,在540nm波长下测定吸光度,从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数,求出样品中糖含量。
五、注意事项
1、DNS配制后需放置一个星期以上才可以用,与物质完全反应需时有关,但最好不要放置太长时间,配置时根据样品量决定用量,一般配两三个月够用即可,每隔一段时间需重新做标准曲线。
2、加热煮沸时最好用电磁炉烧水,沸腾后就把试管放进去,尽量保持试管浸入深度一致,也可买个具塞试管或者在试管口放置个玻璃球,尽量减少蒸发。
3、DNS试剂在棕色瓶中4℃保存,放很久都没有问题。
六、相关问题与解答
1、为什么DNS法适合用于多糖水解产生的多种还原糖体系的测定:因为DNS法显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关,而对还原糖的种类没有选择性,所以适合用在多糖(如纤维素、半纤维素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。
2、DNS试剂放置时间对测定结果的影响:DNS试剂配制后必须放置一个星期以上才可以用,这是因为其与物质完全反应需要一定时间,若放置时间过短,可能导致反应不完全,影响测定结果的准确性,放置时间也不宜过长,一般不超过6个月为宜,否则试剂可能会变质或失效。
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