DNS法是一种常用的还原糖测定方法,以下是关于其测还原糖含量的详细内容:
1、实验原理:DNS即二硝基水杨酸,在碱性条件下,DNS与还原糖发生氧化还原反应,生成3氨基5硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下显棕红色,且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系,因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关,而对还原糖的种类没有选择性,所以适合用在多糖(如纤维素、半纤维素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。
2、试剂制备:将6.3克3,5二硝基水杨酸和262ml 2mol/L氢氧化钠,加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中,再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加水定容到1000ml,即制成DNS试剂,贮于棕色瓶中放置一周后备用。
3、标准曲线绘制
操作步骤:分别取葡萄糖标准液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中,用蒸馏水补足至1.0ml,分别准确加入DNS试剂2ml,沸水浴加热2min,流水冷却,用水补足到15ml刻度,在540nm波长下测定吸光度。
数据记录:假设测定的吸光度值如下表所示(注:实际测定值可能因实验条件等因素有所不同):
葡萄糖标准液体积(ml) | 吸光度 |
0 | 0.000 |
0.2 | 0.120 |
0.4 | 0.240 |
0.6 | 0.360 |
0.8 | 0.480 |
1.0 | 0.600 |
绘制标准曲线:以葡萄糖浓度为横坐标,对应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,通过线性回归等方法得到标准曲线方程,y = 0.600x(其中y为吸光度,x为葡萄糖浓度mg/ml)。
4、样品测定:样品液适当稀释,使糖浓度为0.11.0mg/ml,取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中,加DNS试剂2.0ml,沸水煮沸2min,冷却后用水补足到15ml刻度,在540nm波长下测定吸光度,从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数,进而求出样品中糖含量。
5、注意事项
试剂保存:DNS试剂应贮于棕色瓶中,放置一周后使用,贮存期一般为6个月左右。
反应条件控制:反应过程中的温度、时间等条件需要严格控制,以确保反应的准确性和重复性,沸水浴加热时间应准确控制在规定时间内。
仪器校准:使用的分光光度计等仪器应提前进行校准,确保测量的吸光度值准确可靠。
空白对照设置:在进行样品测定时,应同时设置空白对照,以消除试剂、仪器等因素对测量结果的影响。
DNS法是一种重要的还原糖测定方法,在食品、生物等领域有着广泛的应用,但在实际应用中,需要注意试剂的制备、反应条件的控制以及仪器的使用等方面的问题,以保证测量结果的准确性和可靠性。
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