dns 还原糖

DNS法，即3,5二硝基水杨酸法，是一种常用于测定还原糖含量的方法，以下是关于DNS法的详细内容：

一、实验原理

1、化学反应：在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3氨基5硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系。

2、适用范围：DNS法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中，因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性。

二、DNS试剂的制备

1、甲液配制：称取6.9克结晶酚溶解于15.2毫升10%氢氧化钠溶液中，用水稀释至69毫升，再加入15.2毫升10%氢氧化钠溶液，混匀。

2、乙液配制：称取255克酒石酸钾钠溶于300毫升10%氢氧化钠溶液中，再加入880毫升10%氢氧化钠溶液。

3、丙液配制：取7.5克亚硫酸氢钠溶于300毫升热水中（使用前配制）。

4、混合定容：将上述甲液与乙液混合，加入丙液，用水稀释至1000毫升，盛于棕色瓶中备用。

三、葡萄糖标准曲线的绘制

1、标准葡萄糖溶液配制：准确称取干燥恒重的葡萄糖200毫克，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至500毫升，即含葡萄糖为0.4毫克/毫升。

2、取液与混合：取25×18毫米试管6支，分别按以下顺序加入试剂：3.0毫升DNS试剂、1.0毫升蒸馏水、1.0毫升不同浓度的标准葡萄糖溶液（如0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0毫克/毫升），每管号重复3次。

3、加热反应：将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5分钟，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至25毫升，加塞保存。

4、空白调零与比色：以0号管为空白调零点，在540纳米波长下测定吸光度，以各管的光密度值为纵坐标，对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。

四、样品的测定

1、样品处理：将待测样品处理成适当浓度的水溶液，确保其中的还原糖含量在标准曲线范围内。

2、取液与反应：取一定量的样品溶液（如1.0毫升）于试管中，加入3.0毫升DNS试剂，混匀后在沸水浴中准确加热5分钟。

3、冷却与比色：取出试管，冷却至室温后用蒸馏水定容至25毫升，混匀，在540纳米波长下测定吸光度，记录OD值。

4、含量计算：根据标准曲线的线性回归方程，计算出样品中还原糖的含量。

五、注意事项

1、试剂保存：DNS试剂应保存在棕色瓶中，避免阳光直射，其有效期可能因保存条件而异，一般为数月至半年不等，使用前应检查试剂是否有沉淀或变色现象，如有异常应重新配制。

2、加热控制：加热过程中应严格控制时间和温度，确保反应充分进行且平行性良好，应避免试管直接接触沸水浴底部或壁面，防止局部过热导致溶液溅出或反应不均匀。

3、比色条件：比色时应使用同一型号的分光光度计，并保持比色皿干净、透光面无划痕，每次测定前应先用空白溶液校正零点，以减少误差。

4、样品处理：对于复杂样品（如生物组织提取物），应进行适当的预处理以去除干扰物质（如蛋白质、色素等），必要时可使用离心、过滤或透析等方法进行纯化。

六、优缺点分析

1、优点：操作简便、快速；灵敏度较高；适用于多种还原糖的测定；不需要昂贵的仪器设备。

2、缺点：专一性不强；容易受到杂质的干扰；需要严格控制反应条件和时间；不适用于非还原性糖的测定。

七、相关问题与解答栏目

1、问题一：DNS法测定还原糖时，为什么选择540纳米作为比色波长？

解答：在DNS法中，生成的3氨基5硝基水杨酸在540纳米波长下具有最大吸收峰，选择540纳米作为比色波长可以获得最高的灵敏度和准确性。

2、问题二：如何提高DNS法测定还原糖的准确性？

解答：为了提高DNS法测定还原糖的准确性，可以采取以下措施：确保DNS试剂的新鲜性和准确性；严格控制反应时间和温度；使用高质量的分光光度计进行比色测定；对样品进行适当的预处理以去除干扰物质；制作标准曲线时使用高纯度的葡萄糖作为标准品；重复实验以减少偶然误差等。

DNS法是一种常用的还原糖测定方法，通过了解其实验原理、操作步骤及注意事项，可以有效地应用于实际样品中还原糖含量的测定。