dns测糖

1、实验原理

DNS法，即二硝基水杨酸法，是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3氨基5硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量。

2、DNS试剂的配制

所需材料：酒石酸钾钠、氢氧化钠、3,5二硝基水杨酸、苯酚、无水亚硫酸钠。

配制步骤

称取酒石酸钾钠18.5g，溶于50mL蒸馏水中，加热（不超过50℃），于20mL热溶液中依次加入3,5二硝基水杨酸0.63g、氢氧化钠2.1g、苯酚0.5g、无水亚硫酸钠0.5g，搅拌均匀至溶解透明。

将上述溶液转移至100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至100mL，混匀，过滤后贮存于棕色试剂瓶中，避光保存，有效期为一个月左右（不同来源可能有差异）。

3、葡萄糖标准曲线的绘制

标准葡萄糖溶液的配制：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即得到浓度为2mg/mL的葡萄糖标准液，再分别吸取2mg/mL的葡萄糖标准液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，置于25mL具塞试管中，用蒸馏水补足至2.0mL，得到一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液。

显色反应：向上述各管中分别加入DNS试剂1.5mL，摇匀后沸水浴5min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再向每管加入蒸馏水至25mL刻度线，混匀。

以空白管调零，在540nm波长下，用分光光度计测定各管溶液的吸光度值。

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

4、样品的测定

样品处理：如果是固体样品，需要先研磨成粉末状，然后取一定量样品（精确至0.001g）置于具塞试管中；如果是液体样品，可直接吸取一定体积的样品溶液（如1mL）于具塞试管中，根据样品中还原糖的含量范围，适当稀释样品溶液，使最终测定的吸光度值在标准曲线的线性范围内。

显色反应与测定：向样品管中加入1.5mL DNS试剂，摇匀后沸水浴5min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再向每管加入蒸馏水至25mL刻度线，混匀，以空白管调零，在540nm波长下，用分光光度计测定样品溶液的吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算出样品中还原糖的含量。

5、注意事项

DNS试剂的保存：DNS试剂应贮存于棕色试剂瓶中，避光保存，以防止其见光分解影响测定结果，不同实验条件下，DNS试剂的有效期可能有所不同，一般建议现配现用或定期检查其有效性。

反应条件的控制：显色反应时，应严格控制反应时间和温度，沸水浴时间一般为5min左右，时间过长或过短都会影响显色效果；反应温度应保持在沸腾状态，以确保反应充分进行。

比色测定的准确性：在进行比色测定时，应确保比色皿干净、透光性好，以避免影响吸光度值的准确性，应在反应结束后尽快进行比色测定，以防止产物颜色发生变化影响结果。

相关问题与解答

1、DNS法测定糖含量时，为什么DNS试剂要避光保存？

DNS试剂中的3,5二硝基水杨酸等成分在光照下容易发生分解反应，从而导致试剂的组成和性质发生变化，影响其与还原糖的反应性能以及显色效果，为了保持DNS试剂的稳定性和准确性，需要将其贮存于棕色试剂瓶中并避光保存。

2、如果样品中含有非还原糖，如何用DNS法测定其中的总糖含量？

如果样品中含有非还原糖（如蔗糖），可以先通过酸水解法将非还原性的双糖和多糖降解成还原性单糖，具体方法是在样品中加入适量的酸（如盐酸），加热一段时间后再用碱中和，然后再按照DNS法测定还原糖的操作步骤进行测定，即可得到样品中的总糖含量，最后根据需要扣除原来样品中本身含有的还原糖量（如果有的话），就可以得到非还原糖经水解后产生的还原糖量，从而推算出样品中的总糖含量。

DNS测糖是一种重要的实验方法，通过了解其原理、掌握操作步骤和注意事项，可以准确地测定样品中的糖含量。