DNS测定还原糖方法详解
一、原理
DNS法，即二硝基水杨酸法，是基于在碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3氨基5硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，通过比色法测定反应产物的吸光度，可以间接计算出还原糖的含量。
二、试剂制备
| 序号 | 试剂名称 | 用量 | 配制方法 | 备注 | |
| 1 | 3,5二硝基水杨酸（DNS） | 6.3g | 用400mL蒸馏水溶解 | 需逐步加入氢氧化钠 | |
| 2 | 氢氧化钠（2mol/L） | 262mL | 加到酒石酸钾钠的热溶液中 | 用于调节pH至碱性 | |
| 3 | 酒石酸钾钠（四水合） | 182g | 溶于500mL水中 | 作为反应体系的一部分 | |
| 4 | 重苯酚 | 5g | 加入上述溶液中 | 显色反应所需 | |
| 5 | 亚硫酸钠（无水） | 5g | 加入上述溶液中 | 防止氧化 | |
| 6 | 葡萄糖标准液（1mg/ml） | 准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml | 用于制作标准曲线 |
三、操作步骤
1. 标准曲线制作
| 序号 | 葡萄糖标准液（ml） | 蒸馏水（ml） | DNS试剂（ml） | 沸水浴时间（min） | 冷却后加水（ml） | 测定吸光度（OD540nm） |
| 1 | 0 | 1.0 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 2 | 0.2 | 0.8 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 3 | 0.4 | 0.6 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 4 | 0.6 | 0.4 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 5 | 0.8 | 0.2 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 6 | 1.0 | 0 | 2.0 | 2 | 补足至15 |
2. 样品测定
| 序号 | 样品液（稀释后，ml） | DNS试剂（ml） | 沸水浴时间（min） | 冷却后加水（ml） | 测定吸光度（OD540nm） |
| 1 | 1.0 | 2.0 | 2 | 补足至15 | |
| 2 | |||||
| … |
注：根据实际样品数量调整表格行数。
四、结果计算
根据标准曲线（以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制），查找或计算出样品对应的葡萄糖含量（mg/ml），再根据样品稀释倍数和取样量，计算出样品中的还原糖含量（以葡萄糖计，mg/g或mg/mL）。
五、注意事项
1、DNS试剂需现配现用，存放时间不宜过长，以免影响显色效果。
2、沸水浴时间应严格控制，确保反应完全进行。
3、比色测定时，应确保比色皿干净、无划痕，以免影响吸光度测定。
4、样品测定前应进行适当稀释，使糖浓度在标准曲线范围内。
相关问题与解答栏目
问题1：为什么DNS法适合用于多糖水解产生的多种还原糖体系的测定？
解答：DNS法适合用于多糖水解产生的多种还原糖体系的测定，是因为其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，这使得DNS法能够准确地反映出样品中还原糖的总量，而不受还原糖种类差异的影响。
问题2：如何提高DNS法测定还原糖的准确性？
解答：为了提高DNS法测定还原糖的准确性，可以采取以下措施：确保DNS试剂的新鲜配制和正确保存；严格控制反应条件（如温度、时间等）；使用高质量的分光光度计进行吸光度测定；制作标准曲线时使用高纯度的葡萄糖作为标准品；对样品进行适当的预处理和稀释等，还可以通过多次测定取平均值来减小误差，提高测定结果的准确性。
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