还原糖的测定DNS（3,5二硝基水杨酸）法
一、实验原理
DNS法，即二硝基水杨酸法，是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3氨基5硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，通过比色法测定其吸光度，可以定量测定样品中的还原糖含量，此方法对还原糖的种类没有选择性，适合用于多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中的测定。
二、试剂制备
1、DNS试剂：将6.3克3,5二硝基水杨酸和262ml 2mol/L氢氧化钠溶液，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成DNS试剂，贮于棕色瓶中放置一周后备用。
2、葡萄糖标准溶液：准确称取在105℃的温度下烘干至恒重的葡萄糖0.5g，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至1000ml。
三、标准曲线绘制
| 序号 | 葡萄糖标准液（ml） | 蒸馏水（ml） | DNS试剂（ml） | 吸光度（A540nm） |
| 1 | 0 | 1.0 | 2 | 0.000 |
| 2 | 0.2 | 0.8 | 2 | 0.200 |
| 3 | 0.4 | 0.6 | 2 | 0.400 |
| 4 | 0.6 | 0.4 | 2 | 0.600 |
| 5 | 0.8 | 0.2 | 2 | 0.800 |
| 6 | 1.0 | 0 | 2 | 1.000 |
四、样品测定
1、样品液适当稀释，使糖浓度为0.11.0mg/ml。
2、取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加入DNS试剂2.0ml。
3、沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度。
4、在540nm波长下测定吸光度。
5、从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。
6、求出样品中糖含量。
五、计算方法
还原糖含量（mg/mL）= [(A B) × C] / W
A为样品管吸光度值，B为空白管吸光度值，C为还原糖标准曲线的斜率，W为样品体积（mL）。
六、注意事项
1、DNS试剂需现配现用，避免长时间放置导致性能下降。
2、显色反应需严格控制时间和温度，以确保结果的准确性。
3、比色测定时，需使用相同的比色皿和分光光度计，以减少误差。
七、问题与解答
1、为什么DNS法适合用于多糖水解产生的多种还原糖体系中的测定？
答：因为DNS法显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，多糖水解后会产生多种还原糖，DNS法可以同时测定这些还原糖的总含量，无需分别测定每种还原糖的含量。
2、DNS法测定还原糖含量时，如何提高准确性和重复性？
答：为了提高DNS法测定还原糖含量的准确性和重复性，可以采取以下措施：确保试剂的准确配制和储存；严格控制显色反应的时间和温度；使用校准过的分光光度计进行比色测定；制作标准曲线时使用多个浓度点并进行线性回归分析以提高斜率的准确性；对每个样品进行多次测定并取平均值以减少随机误差等。
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