dns测定总糖

一、DNS法测定总糖的原理

DNS（3,5二硝基水杨酸）在碱性条件下与还原糖共热后被还原成棕红色的3氨基5硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系，由于总糖包括还原糖和非还原糖，通过将样品中的非还原糖用盐酸水解转化为还原糖，再利用DNS法测定水解液中还原糖的含量，进而计算出样品中总糖的含量。

二、实验试剂与仪器

1、试剂：

DNS试剂：称取6.3g 3,5二硝基水杨酸，加少量蒸馏水溶解，转入100mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液29.5mL，再加甘油（丙三醇）10mL，摇匀，冷却后定容至100mL，使用时需避光保存，现用现配。

葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在105℃烘箱中干燥至恒重），用蒸馏水溶解并定容至100mL，混匀，然后分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL该溶液于6支试管中，用蒸馏水定容至2mL，得到不同浓度的葡萄糖标准溶液系列。

盐酸溶液：根据实验需求配制一定浓度的盐酸，用于样品水解。

氢氧化钠溶液：用于调节pH值等。

其他试剂：如乙醇、酚酞指示剂等。

2、仪器：

分光光度计：用于测量溶液的吸光度。

恒温水浴锅：提供反应所需的恒定温度环境。

容量瓶：用于准确配制各种溶液。

移液管：精确移取溶液。

具塞刻度试管：进行显色反应和比色测定。

玻璃漏斗：过滤样品时使用。

滤纸：配合玻璃漏斗过滤。

烧杯：溶解样品等操作。

滴管：添加试剂等。

洗耳球：辅助移液等操作。

三、实验步骤

1、制作标准曲线

取6支具塞刻度试管，分别加入不同浓度的葡萄糖标准溶液2mL，然后向每支试管中加入DNS试剂1.5mL，摇匀。

将各试管同时放入沸水浴中加热5分钟，取出后用自来水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL，摇匀。

以1号试管（空白对照）作为参比溶液，在540nm波长处分别测量各试管中溶液的吸光度。

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品处理

对于固体样品，准确称取适量样品（约含还原糖1 2mg），置于烧杯中，加入蒸馏水煮沸，冷却后过滤，并用蒸馏水洗涤残渣多次，合并滤液，定容至一定体积。

对于液体样品，可直接吸取适量样品稀释至一定体积。

若样品中含有淀粉等非还原性多糖，需先进行水解处理，取适量样品溶液于试管中，加入一定量的盐酸溶液，在沸水浴中加热一定时间（如30分钟），冷却后用氢氧化钠溶液中和至中性，再定容至一定体积。

3、样品测定

吸取处理好的样品溶液2mL于具塞刻度试管中，加入DNS试剂1.5mL，摇匀。

同样放入沸水浴中加热5分钟，取出后用自来水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL，摇匀。

在540nm波长处测量样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量。

四、数据处理与结果计算

1、标准曲线绘制：根据测得的不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，一般采用线性回归分析方法，得到吸光度与葡萄糖含量之间的线性方程，如(y = kx + b)（(y)为吸光度，(x)为葡萄糖含量，(k)和(b)为常数）。

2、样品总糖含量计算：根据样品溶液的吸光度，在标准曲线上查得对应的葡萄糖含量（(m)），按下式计算样品中总糖的含量：

[总糖含量（mg/g或mg/mL）=frac{mtimes V_1}{V_2times W}]

(V_1)为样品定容体积（mL），(V_2)为测定时所取样品体积（mL），(W)为样品质量（g）（对于液体样品，(W)可视为1g）。

五、注意事项

1、DNS试剂应现用现配，避光保存，以免颜色变深影响测定结果。

2、实验过程中，加热时间和温度要严格控制，以确保反应的准确性和重复性。

3、样品水解时，盐酸的浓度和水解时间要根据样品的性质和实验要求进行调整。

4、比色测定时，要保证比色皿的清洁和透光性良好，避免气泡产生。

六、相关问题与解答

1、问题：为什么DNS法测定总糖时要先进行水解处理？

解答：因为总糖包括还原糖和非还原糖，而DNS法只能直接测定还原糖的含量，对于非还原糖（如淀粉等），需要通过水解将其转化为还原糖，才能用DNS法测定，水解过程通常是在酸性条件下进行的，使非还原糖的糖苷键断裂，生成具有还原性的单糖，从而能够与DNS试剂发生反应，进而通过比色法测定总糖含量。

2、问题：如果样品颜色过深，对DNS法测定总糖结果会有什么影响？如何消除这种影响？

解答：如果样品颜色过深，会在比色测定时产生背景干扰，使测得的吸光度偏高，导致计算出的总糖含量不准确，为了消除这种影响，可以采取以下措施：一是对样品进行脱色处理，如使用活性炭吸附等方法去除色素；二是增加空白对照的数量和种类，除了以蒸馏水为空白对照外，还可以设置一个与样品处理过程相同但不加水解和显色步骤的空白对照，以更准确地扣除背景干扰；三是适当稀释样品溶液，降低颜色深度，但要注意保证稀释后的样品仍在标准曲线的线性范围内。