一、实验原理
在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸，在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在特定波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。
二、试剂制备
| 试剂名称 | 用量 | 配制方法 |
| DNS（3，5二硝基水杨酸） | 6.3g | 准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH溶液262ml到含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加结晶酚5g和无水亚硫酸钠5g搅拌溶解，充分混匀，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用 |
| 氢氧化钠溶液 | 262ml（2mol/L） | 按常规方法配制 |
| 酒石酸钾钠 | 182g | 称取相应质量的酒石酸钾钠，用热水溶解 |
| 结晶酚 | 5g | 准确称取结晶酚5g加入上述混合液中 |
| 无水亚硫酸钠 | 5g | 准确称取无水亚硫酸钠5g加入上述混合液中 |
三、葡萄糖标准曲线绘制
1、标准溶液配制：精确称取干燥后的葡萄糖0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液，分别取蒸馏水稀释成不同浓度的葡萄糖标准液，如0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L等。
2、显色反应：分别取不同浓度的葡萄糖标准液1.0ml于25ml刻度试管中，准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min（或根据具体实验要求调整加热时间），流水冷却，用水补足到刻度，摇匀。
3、吸光度测定：在540nm（或550nm等合适波长）波长下测定各溶液的吸光度。
4、绘制标准曲线：以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线并回归出标准方程。
四、样品测定
1、样品预处理：将待测样品液适当稀释，使糖浓度为0.11.0mg/ml。
2、显色反应：取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到刻度。
3、吸光度测定：在与绘制标准曲线相同的波长下测定吸光度。
4、计算含量：从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中糖含量。
五、注意事项
1、DNS试剂应贮于棕色瓶中，放置一周后使用，且需避光保存，以防止试剂变质影响实验结果。
2、实验过程中，显色反应的条件（如加热时间、温度等）应严格控制一致，以确保结果的准确性和可比性。
3、分光光度计在使用前应预热并调零，测量时比色皿应保持清洁，避免杂质影响吸光度的测定。
六、相关问题与解答
问题1：DNS法测定葡萄糖时，为什么选择540nm（或550nm等）波长进行吸光度测定？
解答：因为在该波长下，DNS与葡萄糖反应生成的棕红色物质3氨基5硝基水杨酸有最大吸收峰，此波长下测定的吸光度值最能反映葡萄糖含量与颜色深浅的关系，从而保证测定的准确性和灵敏度。
问题2：如果样品颜色较深，对DNS法测定葡萄糖结果有何影响？如何消除？
解答：如果样品本身颜色较深，会干扰吸光度的测定，使测定结果偏高，可以在测定前对样品进行脱色处理，如采用活性炭吸附等方法去除色素，然后再进行DNS法测定；或者通过设置空白对照，扣除样品本身颜色带来的吸光度值，以减小误差，但需要注意的是，脱色处理可能会影响样品中葡萄糖的含量，因此需要选择合适的脱色方法和条件，并进行验证和校正。
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