DNS法如何用于测定还原糖？

DNS测还原糖

一、引言

DNS（3,5二硝基水杨酸）比色法是一种常用的测定还原糖含量的方法，该方法基于碱性条件下，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成棕红色的氨基化合物，通过比色法在特定波长下测定吸光度，即可推算出样品中的还原糖含量，由于其操作简便、灵敏度高、重现性好，DNS法广泛应用于食品工业、生物化学及环境监测等领域，本文将详细介绍DNS法的实验原理、试剂制备、标准曲线绘制及样品测定方法，并探讨相关注意事项和常见问题。

二、实验原理

DNS比色法的原理是利用DNS在碱性条件下与还原糖共热后，被还原生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸，该产物在过量的氢氧化钠碱性溶液中显色，并在540nm波长处有最大吸收，在一定浓度范围内，还原糖的含量与吸光度值呈线性关系，因此可以通过比色法测定样品中的还原糖含量。

三、试剂制备

DNS试剂配制

材料：

6.3克3,5二硝基水杨酸（DNS）

262毫升2摩尔/升氢氧化钠溶液

182克酒石酸钾钠

5克苯酚

5克亚硫酸钠

蒸馏水

步骤：

1、将6.3克DNS溶于少量蒸馏水中。

2、加入262毫升2摩尔/升氢氧化钠溶液。

3、逐步加入182克酒石酸钾钠、5克苯酚和5克亚硫酸钠。

4、温水浴（不超过48℃）加热，不断搅拌直至溶液清澈透明。

5、冷却后用蒸馏水定容至1000毫升。

6、贮存于棕色瓶中，静置57天后使用，贮存期为6个月。

葡萄糖标准溶液配制

材料：

准确称取干燥恒重的葡萄糖100毫克

蒸馏水

步骤：

1、将100毫克葡萄糖溶解于少量蒸馏水中。

2、以蒸馏水定容至100毫升，即得1毫克/毫升的葡萄糖标准溶液。

四、标准曲线绘制

标准曲线制作步骤

材料：

不同体积的葡萄糖标准液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5毫升）

DNS试剂

蒸馏水

试管、沸水浴、分光光度计等器材

步骤：

1、分别取葡萄糖标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5毫升于不同的15毫升试管中。

2、用蒸馏水补足至1毫升，分别加入2毫升DNS试剂。

3、将试管置于沸水浴中加热5分钟，冷却后用蒸馏水补足至15毫升刻度。

4、在540纳米波长下测定各试管的吸光度。

5、以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

标准曲线数据表

五、样品测定

样品处理

材料：

发酵液样品（稀释一定倍数）

蒸馏水

DNS试剂

试管、沸水浴、分光光度计等器材

步骤：

1、将发酵液样品适当稀释，使糖浓度为0.11.0毫克/毫升。

2、取稀释后的糖液1.0毫升于15毫升刻度试管中。

3、加入2.0毫升DNS试剂，混匀后置于沸水浴中煮沸5分钟。

4、冷却后用蒸馏水补足至15毫升刻度。

5、在540纳米波长下测定吸光度。

6、根据标准曲线查出葡萄糖毫克数，计算样品中的糖含量。

六、结果与讨论

实验结果分析

通过DNS比色法测定的样品吸光度值，可以从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，根据样品的稀释倍数，计算出原始样品中的还原糖浓度，实验结果表明，DNS法具有较高的灵敏度和重现性，适用于多种复杂体系中还原糖的测定。

影响因素探讨

在实验过程中，可能影响测定结果的因素包括：

试剂质量：DNS试剂的纯度和新鲜度直接影响显色效果。

反应条件：加热时间和温度的控制必须严格，以确保反应充分进行。

仪器精度：分光光度计的准确性和稳定性对测量结果至关重要。

样品处理：样品的稀释倍数和均匀性会影响最终的测定结果。

七、注意事项

1、试剂贮存：DNS试剂应避光保存，避免长时间暴露在阳光下，以免失效。

2、安全防护：实验过程中应注意防护措施，避免化学品溅入眼睛或皮肤。

3、仪器校准：定期校准分光光度计，确保测量结果的准确性。

4、样品处理：样品应充分混匀，确保取样的代表性。

八、相关问题与解答

1. DNS比色法测定还原糖的原理是什么？

答：DNS比色法的原理是在碱性条件下，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸，该产物在过量的氢氧化钠碱性溶液中显色，并在540nm波长处有最大吸收，在一定浓度范围内，还原糖的含量与吸光度值呈线性关系，因此可以通过比色法测定样品中的还原糖含量。

如何绘制DNS比色法的标准曲线？

答：绘制DNS比色法的标准曲线需要以下步骤：

1、准备不同浓度的葡萄糖标准溶液。

2、分别取一定量的葡萄糖标准溶液于试管中，用蒸馏水补足至相同体积。

3、向每个试管中加入等量的DNS试剂，混匀后置于沸水浴中加热一定时间。

4、冷却后用蒸馏水补足至相同体积，测定各试管的吸光度。

5、以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。